（一）試劑PCR儀
?。?）引物：決定擴增的特異性。根據(jù)檢測的DNA不同，選用不同引物，每種病原微生
物都有自己特異的引物。
?。?）耐熱的DNA聚合酶：此酶是從耐熱細菌中分離出來的，能耐受高溫90℃-100℃。
?。?）10×PCR緩沖液：500mmol/l KCl;100mmol/L Tris-HCl（pH8.4,20℃）150mmol/L MgCl2,1mg/ml明膠。10×PCR緩沖液隨酶一起購買。
?。?）5mmol/L dNTP貯備液：將dATP、dCTP、dGTP和dTTP鈉鹽各100mg合并，加入滅菌去離子水溶解，用NaOH調(diào)pH至中性，分裝每份300μl，-20℃保存。dNTP濃度用UV吸收法測定。現(xiàn)用dNTP溶液均有商品化產(chǎn)品。
?。?）DNA模板：用處理液將待測標本處理，不同處理方法、操作各異，但目的是暴露標本中被檢測的DNA。
（二）操作程序PCR儀
過去標準的PCR操作程序是將PCR儀必需反應成份分別加入一微量離心管中，然后置于一定的循環(huán)參數(shù)條件下進行循環(huán)擴增。具體如下：
?。?）向一微量離心管中依次加入
DNA模板 102-105拷貝
引物 各1μmol/L
dNTP 各200μmol/L
10×PCR緩沖液 1/10體積
ddH2O 補到終體積（終體積50μl-100μl）
混勻后，離心15s使反應成分集于管底。以上步驟僅在實驗研究用，現(xiàn)在商品化試劑已將dNTP、10×PCR緩沖液，引物，ddH2O混合在一起，反應體積為20-25μl，只要試驗人員加入處理好的樣品就可以了。
?。?）加石蠟油50-100μl于反應液表面以防蒸發(fā)。置反應管于97℃變性10min。
?。?）冷至延伸溫度時，加入1-5u Taq DNA聚合酶，離心30s使酶和反應液充分混合。現(xiàn)在臨床使用試劑酶通常已加入反應液中。
（4）PCR儀的循環(huán)程序為：94℃變性30s，55℃退火20s，然后在72℃延伸30s，共循環(huán)30-35次。zui后一次循環(huán)結(jié)束后，再將反應管置72℃溫育5min，以確保充分延伸。
PCR儀尚可用于組織標本DNA的擴增。由于固定組織標本的DNA常發(fā)生降解，就給常用的分析方法如Southern轉(zhuǎn)印雜交等帶來一定困難。87年Impraim等人首先將PCR技術(shù)引入固定包埋組織內(nèi)DNA分析。他們先從組織標本中提取DNA，再用PCR進行特異性的DNA擴增，應用這種方法，他們成功地從保存30至40年之久的組織標本DNA中擴增了HPV病毒基因片段。但這種方法需要提取DNA，操作比較繁瑣。1988年Shibata等人對Impraim的方法進行了改進。他們將固定包埋的組織塊制成5-10um厚，0.4cm大小的切片。將切片放入容積為500μl的Eppendorf管內(nèi)。加入400μl二甲苯脫脂，離心除去二甲苯，用400μl 95%乙醇洗去殘余二甲苯。離心除盡乙醇、加入100μlPCR反應基質(zhì)，將Eppendorf管放入沸水浴中煮10min，然后按前述PCR方法進行DNA擴增。
在應用PCR方法檢測RNA病毒時，首先應將RNA轉(zhuǎn)化成cDNA才能進行擴增，因為PCR只能對DNA模板進行擴增，我們把這種RNA的PCR反應稱為反轉(zhuǎn)錄PCR，簡稱RT-PCR。把由RNA轉(zhuǎn)化成DNA的過程叫做反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄需要在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下完成。 文章關(guān)鍵詞：PCR儀 |
